Problembehandlung: schwaches / kein Signal und andere

Bewältigen Sie Ihre Western-Blot-Probleme mit unseren Ratschlägen zur Fehlerbehebung, welche Probleme wie ein schwaches oder gar kein Signal, unspezifische Banden, ein hohes Signal und andere häufige Probleme abdecken.

Probleme mit dem primären und / oder sekundären Antikörper

• Titriere den Antikörper um die optimale Konzentration zu bestimmen.

• Der Antikörper kann an Aktivität verloren haben - führen Sie einen Dot Blot durch um die Aktivität und optimale Konzentration zu bestimmen.

• Beziehen Sie eine positive Kontrolle mit ein (z. B. überexprimiertes Protein, gereinigtes Protein, positive Zelllinie usw. Passen Sie die Proteinbeladung entsprechend an).

• Ändern Sie die Inkubationszeit und Temperatur (4 ° C über Nacht).

Zielproteinhäufigkeit ist zu niedrig

• Laden Sie mehr Protein je Vertiefung.

• Reichern Sie Proteine ​​mit geringer Häufigkeit durch Immunpräzipitation, Fraktionierung usw. an.

• Verwenden Sie eine geeignete Behandlungsmethode um die Expression oder Modifikation von Zielproteinen zu induzieren.

• Stellen Sie sicher, dass die Probe nicht abgebaut wurde.

• Fügen Sie Protease-Inhibitoren in den Lysepuffer hinzu.

• Verwenden Sie den optimalen Lysepuffer für die subzelluläre Lokalisierung des Zielproteins.

• Überprüfen Sie die Proteinbeladung mit einem Kontroll-Antikörper.

Membranwahl

• Wählen Sie PVDF- oder NC-Membranen basierend auf die Hydrophobie / Hydrophilie des Zielantigens.

• Überprüfen Sie die Hydrophobie / Hydrophilie der Antigensequenz.

• Die PVDF-Membran eignet sich für hydrophile / polar / geladene Zielantigene.

• Nitrocellulose funktioniert besser mit hydrophoben / nicht-polaren Antigenen.

Probleme mit dem Blocking-Puffer

• Zu langes Blockieren kann spezifische Epitope “maskieren” und eine Antikörperbindung verhindern.

• Verringern Sie den Prozentsatz des Blockierungsreagenzes aus den Antikörper-Inkubationspuffern oder entfernen Sie es.

• Wechseln Sie zu einem alternativen Blockierungsreagenz.

Targets mit niedrigem Molekulargewicht

• Verwenden Sie ein Tris-Tricin-Gel für Target-Proteine <20 kDa.

• Reduzieren Sie die Transferzeiten und / oder verwenden Sie Membranen mit kleinerer Porengröße (0,22 μm) für Proteine ​​mit niedrigem Molekulargewicht <30 kDa.

• Der Nasstransfer wird für kleine Proteine ​​(10 kDa) empfohlen.

Misslungene Übertragung

• Stellen Sie sicher, dass der Übertragungsaufbau korrekt ist (z. B. keine Luftblasen zwischen Gel und Membran).

• Dickere Gele können zu einer unvollständigen Übertragung von Proteinen mit hohem Molekulargewicht führen.

• Überprüfen Sie die Qualität des Proteintransfers mit einer reversiblen, universellen Proteinfärbung (z.B. Ponceau-S).

• Ein Nasstransfer erzeugt eine höhere Auflösung als ein halbtrockener Transfer.

Natriumazid-Kontamination

• Das Vorhandensein von Natriumazid hemmt die Aktivität von HRP.

• Verwenden Sie Natriumazid-freie Puffer.

• Auf gründliche Wäsche achten.

Filmbelichtung zu kurz / Detektionsreagenz nicht empfindlich genug

• Versuchen Sie mehrere Belichtungszeiten um eine optimale Erkennung zu erzielen.

• Probieren Sie unterschiedliche Zusammensetzungen der Nachweisreagenz und / oder verschiedene Marken aus.

• Chemilumineszenz-Reagenzien in hochreinem Wasser verdünnen.

Weitere Blotting-Probleme

Geisterbanden

• Entstehen wenn das ECL-Substrat zu schnell verbraucht wird.

Überladung der Probe

• Verringern Sie die Gesamtproteinbelastung für jede Probe.

Zu viele Antikörper

• Verringern Sie die Konzentrationen der primären und / oder sekundären Antikörper.

Inverse Färbung (d.h. Weiße Streifen auf einem dunklen Fleck)

• Zu viel primärer und / oder zu viel sekundärer Antikörper.

• Verwenden Sie Antikörper in höheren Verdünnungen.

Färbung der Molekulargewichtsmarker

• Der Antikörper reagiert mit dem Molekulargewichtsmarker.

• Fügen Sie zwischen dem Molekulargewichtsmarker und der ersten Probenspur eine leere Spur hinzu.

"Lächelnde" Bande

• Die Migration durch das Gel war zu heiß oder zu schnell.

• Reduzieren Sie die angelegte Spannung um das SDS-PAGE-Gel laufen zu lassen oder führen Siedie Migration in einem kalten Raum durch.

Leere Bereiche / weiße Flecken

• Kann durch eine unsachgemäße / ungleichmäßige Übertragung oder Luftblasen verursacht werden.

Unspezifische Banden

• Hohe Proteinkonzentrationen können zu diffusen Proteinbanden führen.

• Ungleichmäßige Proteinbeladung: Proteinproben untersuchen und je nach Proteinmenge aufladen. Überprüfen Sie auf gleichmäßige Proteinbeladung indem Sie den Blot mit einem internen Kontrollantikörper abziehen und es erneut versuchen (oder verwenden Sie einen HRP-konjugierten Ladungskontrollantikörper).

• Ungleichmäßige Gelzusammensetzung (das Gel hat sich während das Gießens zu schnell verfestigt  oder der Puffer wurde unzureichend vermischt).

• Ungleiche Banden können dadurch entstehen, dass während des Laufvorgangs nicht genügend Puffer zum Tank hinzugefügt wird.

Dunkle Flecken / Punkte

• Dieses Problem kann durch Antikörper verursacht werden, die sich an das Blockierungsreagenz im Blockierungspuffer binden.

• Wechseln Sie das Blockierungsreagenz.

• Filtere den Blockierungspuffer.

• Waschen Sie überschüssiges Detektionsreagenz vor der Belichtung von der Membran ab.